在流式检测中为什么低吸附磁性荧光编码微球的检测效果会更好

流式荧光技术又称悬浮阵列、液相芯片等，是近年来逐渐发展起来的多指标联合诊断技术。该技术以荧光编码微球为核心，集流式原理、激光分析、高速数字信号处理等多种技术于一体，多指标并行分析。该项技术其不仅拥有化学发光高灵敏度、高精密度的优势，同时还具备高通量、快速、并行检测等特点，既可适用于临床检验也适用于科研，而且检测时对样本需求量极少，特别适合一些珍贵样本的多指标分析。此外，平台具有良好的开放性和拓展性，用户可根据自己的需求来设计和实现对不同目标分子的联合检测。

尽管流式荧光技术能同时检测多种抗原，但在研发中可能会遇到一种情况：采用流式荧光法检测单一或少数几种指标能实现高灵敏检测，然而当指标数进一步增加时，原本某一个本来灵敏度很高的指标可能会出现目标抗原浓度为0的标样的检测荧光值突然升高而导致灵敏度显著下降的情况。以下是我们在开发多细胞因子检测试剂时遇到的一个真实的例子：图1（a）为我们构建一个9659个细胞因子联检时做标曲，其中的TNF-a的标准曲线。从结果中可知即使当抗原浓度低至3.4 pg/mL也在标准曲线线性范围内。此时，我们再增加一个细胞因子（共10因子），此时，再对TNF-α验证标准曲线时，会发现TNF-α浓度为零的标样荧光检测值显著升高（MFI从原来的142增加至984，相同的仪器，同样的测试条件），随之而来的是标曲的线性范围覆盖下限明显不足（b）。

                         图1 （a）9因子检测时TNF-α的标曲；（b）增加到10因子检测时TNF-α的标曲

  当然，这是一个比较特别的例子，不一定在所有的实验中都会出现这样急剧增高的现象。然而，我们还是经常会遇到随着检测目标抗原种数的增加，抗原浓度为0的标样中检测荧光值会逐渐升高的情况，只是升高得没那么显著。

  接下来，让我们来思考一下，为什么随着检测目标抗原种数的增加，个体微球群在标准品浓度为0时的标样检测荧光值会增加呢？不难想到，这个主要是由于微球与荧光检测抗体间发生非特异性吸附导致的（我们把这种由于微球和荧光检测抗体通过非特异性吸附产生的荧光增值叫做噪音，示意图如图2）。随着联检项目的增加，荧光检测抗体的种数也会随之增加，故而通过非特异性吸附，结合到个体微球群的荧光检测抗体也会增加，也就是噪音也会增加。

                                                  图2 微球上的噪声示意图

     这种情况对一些要求灵敏度较高的检测项目明显是不利的。此外，由于荧光检测抗体与个体微球群之间的吸附是一种比较弱的结合力，容易受到多种因素的影响而产生波动。因此，当用于血清样本检测时，血清中存在的各种蛋白质会与荧光检测抗体竞争微球的非特异性吸附位点，最终的结果是导致检测到的荧光信号不能正确的对应血清中各抗原的浓度，这种影响在含低浓度抗原的血清中尤为明显。以细胞因子检测试剂盒为例，我们会发现对一些正常人血清进行细胞因子检测时，很大概率会出现荧光检测值低于对照品为0的标样，从而算不出细胞因子的浓度（图3为细胞因子检测出现负值的原因分析示意图3）。从我们掌握的数据来看，即使是一些主流的进口多细胞因子试剂，对正常人血清各个因子的检测率不到50%。

图3 在噪音高时，低值血清样本检测荧光值出现负值的原因分析示意图

    有没有好的方法去降低噪音呢？针对这个问题，碧芯生物科技开发出低吸附磁性荧光编码微球，这种微球经过特殊的工艺处理，对荧光检测抗体的非特异性吸附非常低。那么如果采用这种微球做试剂，图1所出现的问题能否得到解决呢？接下来我们又做了实验，用低吸附磁性荧光编码微球替代图1中使用的普通磁性荧光编码微球，同样做成10因子检测试剂盒，我们惊喜的发现，TNF-α微球群噪音值得到明显的改善，由原来的844降低到6，与之对应的是标准曲线覆盖的浓度范围又可以低至3.4 pg/mL了

   最后我们对比了采用低吸附微球构建的12细胞因子检测试剂与进口七因子检测试剂在噪声方面的差异，如图所示，采用碧芯生物生产的低吸附磁性荧光微球生产的12细胞因子检测试剂的噪声不到进口同类试剂的5%（图5）。通过降低噪音，碧芯生物12因子检测试剂显著提升了各个细胞因子对于正常血清的检出率，各因子检出率均高于90%。

                                     图5碧芯生物试剂与某进口th1/th2/th7七因子检测试剂噪声对比