CBA法多细胞因子检测的关键-表面活性基团数

 流式荧光检测技术又叫液相悬浮芯片技术，自诞生以来，由于其灵敏而准确的光学编码鉴别、快速的反应动力学、灵活的检测项目组合、可实现定量分析以及同时适用于蛋白与核酸分子检测等特点而成为多重指标联合检测的技术平台。

  荧光编码微球是该项技术的灵魂，它不仅仅影响待检测物的重数，检测试剂的稳定性，其表面活性基团的数量（用于连接抗原或核酸）更是直接影响检测的灵敏度和准确度。因此在考虑一种荧光编码微球适不适合做流式荧光法检测试剂盒的原料时，其表面活性基团是个非常重要的指标。

图1 荧光编码微球的重要参数

  目前市面上大部分荧光编码微球表面采用羧基修饰，厂家一般也会给出他们生产的微球表面的羧基量，一般通过滴定测得，单位为µeq/g。如图2，显示了碧芯生物3μm球的表面滴定数据。一般而言，微球的粒径越小，比表面积就越大（与粒径的平方成反比），此时达到相同的羧基密度，小粒径的微球的表面滴定数据就会越大。对于相同粒径的荧光编码微球，表面滴定数据越大说明表面羧基密度越高。

图2  碧芯生物3μm球的表面滴定数据

然而在实际样本的检测中，表面羧基滴定数据仅能作为参考，却并不能直接反映表面偶联抗体密度。例如，我们并不知道当表面的羧基滴定度达到多少时，我们可以将捕获抗体满满的结合在微球表面；此外，当与其他活性基团修饰的荧光编码微球比较时（比如与表面亲和素修饰的微球比较时），表面多少的羧基量的球与表面多少亲和素量的微球能结合同样多的捕获抗体呢？因此，仅得知羧基修饰的荧光编码微球表面羧基量来判断其是否可作为流式荧光法检测试剂盒的原料是远远不够的，只有直接测定微球结合捕获抗体后微球表面的抗体密度，甚至计算出平均每个荧光编码微球上能结合抗体的最大数量，才能真正直观反映微球的品质。然而，想要直接测定微球表面能结合的捕获抗体的量比较困难。有人采用间接法，也就是先将已知浓度且过量的抗体偶联到已知数量的荧光编码微球，分离微球后通过测定溶液中残余的抗体量来测定微球表面的抗体结合量。这种方法由于采用间接法，分离时溶液中的抗体损失都会计算成微球所结合的抗体，且测定溶液中抗体残余的检测一般采用显色法，该方法的灵敏度较差，因此该方法测到的数据不够准确。此外，该方法相对繁琐，如果作为质量控制的方法，不够便捷。

    面对这一问题，碧芯公司也经过反复的思考和大量的研究摸索，建立了能准确测定荧光编码微球表面能结合的最大抗体量的方法。如图3所示，我们采用藻红蛋白替代抗体，将藻红蛋白偶联到荧光编码微球表面后，采用流式细胞仪测定微球表面的藻红蛋白荧光信号（模拟表面捕获抗体）。藻红蛋白偶联的量越多，荧光越强，从而构建PE的荧光强度与PE偶联量的相关性。计算出微球表面的藻红蛋白数量。由于该方法采用直接测定微球表面的藻红蛋白荧光信号，因此更能准确反映微球表面结合藻红蛋白的数量。

图3 基于藻红蛋白的微球偶联抗体容量评价方法的建立

表1 碧芯生物Beadstar-mPlex®系列光编码微球表面PE偶联密度检测结果

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Beadstar-mPlex®磁性荧光编码微球共计3种尺寸，每种尺寸微球可编码30-70重荧光。表面修饰集团包括：Avidin、氨基、羧基。具体参数如下表所示：