碧芯生物助力生物实验—小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的获得

树突状细胞（Dendritic cells, DCs）在天然识别病原体和随后的适应性免疫反应的活化中发挥着关键作用。DCs通过主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递抗原肽来诱导T细胞活化和分化，从而启动适应性反应。DC还可分泌细胞因子和生长因子，增强并调节免疫反应。除了活化Naive T细胞的作用外，DCs被认为在引导效应性T细胞的分化以及T细胞耐受性的发展中起着关键作用。虽然DCs存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要， 所以学者们尝试多种方法来体外培养和扩增DC。对于人DCs的获得，常用的方法是从人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMCs）诱导产生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生, 即骨髓来源的DC（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells, BMDCs）。

鉴于功能分析和分子生物学研究的需要，获得更高数量和更高纯度的BMDCs是大家一直追求的目标。碧芯生物特邀海南医学院的张老师与大家分享BMDCs的经典制备方法(Lu, Zhang et al. 2021)，大家可根据自身需要选择使用，因为试剂的品牌，货号可能对BMDCs的制备质量具有很大的影响，因此，我们列出了所用的所有试剂的品牌及货号,以供参考。

1.     试剂的准备

1)   BMDCs培养基：取10 mL胎牛血清（Gibco，货号：1932597），加入90 mL        RMPI 1640培养基（博士德，货号：PYG0066），加入β-巯基乙醇               （Amresco，货号：0482）使得终浓度为50 µM ，具体为取10 µL β-巯基乙醇        加入到1 mL PBS（博士德，货号：PYG0021），混匀后再从中取出34 µL，         加入至上述的100 mL培养基中即可。

2)  GM-CSF： GM-CSF是成功获得BMDCs的关键试剂，我们实验室选用的abcam的小鼠重组GM-CSF（abcam货号：ab9742），预先配制成2 µg/mL的溶液并分装保存在-80 ^oC：取20 µg GM-CSF，先用 10 mL 含10% FBS（Gibco，Lot：193259）的RMPI 1640培养基（博士德，货号：PYG0066）溶解，用无菌无内毒素的1.5离心管分装成每管100 µL，放置于-80 ^oC。

2.     获得BMDCs

1)    取C57bl/6j小鼠一只，颈椎脱臼法处死，并在消毒酒精中浸泡2分钟，在超净工作台中手术取出所有股骨和胫骨并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净，浸泡在2 mL PBS中（PBS置于6孔细胞培养板（Corning，货号：13418002 ）中的一孔）；将骨移入6孔板中的另一个盛有2 mL PBS的新孔中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨*变白；收集骨髓悬液，并用45微米细胞过滤网过滤（Jet Biofil，货号：CSS010040），收集细胞悬液，1000 g离心3分钟，弃上清，往沉淀中加入1 mL红细胞裂解液（Biosharp，货号：69015473），轻轻吹打使细胞分散，1分钟后1000 g离心3分钟，弃上清，沉淀用PBS（博士德，货号：PYG0021）洗涤一次，最终用2 mL BMDCs培养基分散，并将细胞分散液转移至直径为90 mm细菌培养皿（Nest，货号：752001）中，再补入6 mL BMDCs培养基，加入80 µL预先配好的GM-CSF溶液(2 µg/mL)使终浓度至20 ng/mL，于二氧化碳培养箱（37 oC， 5% CO2）中培养48小时。

2)   48 h后，再加入8 mL BMDCs培养基以及 80 µL GM-CSF （2 µg/mL）,继续培养72小时；

3)   72 h后，换液，并加入80 µL GM-CSF (2 µg/mL)。 注意上清中的细胞不要丢弃。我们的做法如下：将上清转移至15 mL无菌离心管中（Corning，货号：15620023）,1000 g离心3分钟，弃上清，细胞用8 mL BMDCs分散再加回至原细胞培养皿中，再加入GM-CSF 80 µL，在二氧化碳培养箱中继续培养24 h。

4)    24 h后，取出细胞培养皿，小心晃动细胞培养皿使悬浮细胞分散均匀，取出含有悬浮细胞的培养液离心（注意不要收集贴壁细胞），弃去上清，细胞用含有10%FBS的1640培养基（博士德，货号：PYG0066）分散并测定细胞浓度，并接种在细胞培养板上，细胞培养板的尺寸根据个人实验确定。此时获得的BMDC细胞为未成熟的DC细胞。

5)       加入LPS（Sigma， SMB00610）刺激24 h，我们就可以获得成熟的BMDCs细胞。

图1 BMDCs制备方法示意图

3鉴定BMDCs

如何鉴定获取了的BMDCs细胞并诱导了DC细胞的成熟呢？本实验室一般通过用荧光标记的CD11c以及CD80、CD86染色，再用流式细胞技术，通过CD11c阳性细胞的比例明确BMDCs的纯度，通过CD80、CD86双阳的比例明确成熟BMDCs的比例。

此外，我们还通过对比无药物刺激与LPS刺激BMDCs 24 h后，二者的细胞培养上清中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等细胞因子表达水平的变化来确定BMDCs是否成功获取以及成熟状态。对于细胞因子检测方面，要同时检测细胞上清中多个细胞因子的含量，采用ELISA工作量较大，且细胞上清有时可能不够，因此使用碧芯生物科技有限公司的Beadstar-mPlex^TM小鼠多细胞因子检测试剂盒（货号：BS-MC01）可以满足一次检测多个细胞因子的需要。通过流式细胞技术，只需要25 µL样本，就可以同时检测IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等多个细胞因子的浓度。附图为无药物刺激与LPS刺激DC细胞24 h后，细胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的浓度（采用Beadstar-mPlex^TM多细胞因子检测试剂盒测得）。

图2. 无药物刺激与LPS刺激BMDCs细胞24 h后，细胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的浓度

参考文献：

Lu, Z., Y. Zhang, et al. (2021). "A biotin-avidin-system-based virus-mimicking nanovaccine for tumor immunotherapy." Journal of Controlled Release 332: 245-259.